皮病时以胶原为主的细胞外基质(ecm)合成异常增多的病理机制仍不清楚 。真皮成纤维细胞(fb)是合成ecm的主要细胞 ， 研究发现硬皮病局部存在着高产量胶原和其他ecm的异常fb亚群 ， 但这种异常亚群的激活机制及其表面分化抗原的特征均不清楚 。近年来 ， 发现ecm-细胞间作用对调控细胞的迁移、趋化性、增殖、分化和特异性基因的表达具重要作用；而介导ecm-细胞间作用的最主要受体是粘附分子整合素家族 ， 研究其在硬皮病中的表达特征对揭示硬皮病ecm合成过多的病理机制具有重要意义 。我们运用原位杂交方法研究了整合素α5、β1亚基在20例硬皮病皮损区的表达情况 ， 并与非皮损部位及正常人皮肤进行比较 。
文章插图
一、材料与方法
1.病例：硬皮病患者20例 ， 为1995年1月至1996年12月在本院皮肤科就诊的患者 ， 均经临床及病理所证实 ， 其中男7例 ， 女13例；年龄9～46岁 ， 平均年龄27.6岁；病程2～16个月不等；其中2例局限性硬皮病 ， 18例系统性硬皮病 。正常人皮肤对照20例 ， 男8例 ， 女12例；年龄12～40岁 ， 平均25.2岁 ， 均为本院外科手术的非皮肤病患者 。标本离体后半小时内液氮速冻 ， oct包埋 ， －20℃恒温连续切片(7～8μm) ， 4％多聚甲醛固定 ， 梯度酒精脱水后 ， －70℃保存 。
【原位杂交方法研究整合素α5β1在硬皮病的表达】 2.主要试剂：整合素α5、β1亚基质粒由美国human genome sciences ， inc倪健博士惠赠 。限制性内切酶ecorⅰ、xhoⅰ及rna酶购自华美生物技术公司 。鲑鱼精dna、多聚蔗糖、pvp、牛血清白蛋白、硫酸葡聚糖、depc为华顺生物技术公司产品 。预杂交液配方参见文献[1] 。杂交液为预杂交液中加入相应探针 。地高辛标记试剂盒为boehringer mannheim公司产品 。
3.探针制备及标记：整合素α5、β1质粒的转化、鉴定、扩增、抽提及回收均参照文献[2] ， 其序列长度分别为628bp、1020bp 。探针标记采用地高辛试剂盒进行标记(随机引物法)；并依据点杂交方法估计地高辛标记探针的量：α5探针为3ng/μl ， β1探针为5ng/μl 。
4.原位杂交：详细步骤参见文献[1] 。其中蛋白酶k浓度为2μg/ml ， 经预杂交、杂交后 ， 参照地高辛标记试剂盒说明书 ， 加入标记生物素的抗地高辛抗体 ， 进行显色反应→梯度酒清脱水→透明封片 ， 显微镜下观察结果 ， 棕黄色或褐色为阳性 。
二、结果
在真皮乳头层及真皮下层整合素α5或β1表达阳性的细胞呈散在或灶状分布 。皮损部位阳性细胞明显多于非皮损部位及正常皮肤 。此外 ， 在表皮、真皮的细胞间也可见整合素α5、β1分布 。在放大10×40倍光镜下 ， 对每一标本任取5个不同的视野 ， 在装有10×10的网格目镜测微器下计数每一方格(1cm×1cm)中fb平均阳性细胞数(阳性细胞密度)；所得结果用t检验进行统计学分析 。结果表明硬皮病皮损α5、β1亚基mrna表达较非皮损区及正常人皮肤均显著增高 。见表1 。
表1 硬皮病患者皮损、非皮损及正常人皮肤整合素α5、β1
亚基表达的阳性细胞密度（±）
分组例数整合素α5整合素β1阳性细胞浓度t值*p值阳性细胞浓度t值*p值硬皮病皮损组2066.2±8.56.868〈0.0176.0±9.86.777〈0.01硬皮病非皮损组2016.2±2.03.967〈0.0118.5±2.12.065〈0.05正常人组207.5±0.9--9.0±1.3-- 注：皮损与非皮损组比较α5亚基：t值=5.762 ， β1亚基：t值=5.739 ， p值均〈0.01
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