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三种方法分离新生隐球菌RNA及其评价( 二 )

生活百科隐球菌


二、结果
(一)匀浆新生隐球菌菌体时 ， 每隔1分钟进行墨汁涂片检查和培养 ， 在第3分钟时镜检和培养 均未见菌体 ， 重复试验时也未查见 。
(二)无论是方法1还是方法2、3 ， 电泳检测rna时 ， 紫外光照射下可见清晰的3条带 ， 以啤酒 酵母和小白鼠肝细胞rna作为对照 ， 显示其大小分别为25s、18s和5s ， 即三种方法均获得了 能检测到的rna 。
(三)每次取3个样本 ， 以其平均数作为菌量 ， 以分光光度计所测数值计算rna的浓度和纯度 ，  重复5次后 ， 比较3种方法的算术平均数 。结果显示：方法1、2所获得的rna可见轻微dna污染  ， 且其产量略低于方法3 ， 方法3相对纯度高 ， 但三者的量均低于用同样的方法3所获得的小 鼠肝细胞rna而接近于啤酒酵母的rna含量 。
附表　3种方法所抽提的新生隐球菌rna的各种参数
方 法比率(260/280nm)dna产量 (μg/105个)方法11.73±0.08测出1.14±0.04方法21.76±0.04测出1.09±0.02方法3新　生
隐球菌1.85±0.05未测出1.23±0.04　啤酒酵母1.86±0.05未测出1.26±0.05　小　鼠
肝细胞1.86±0.04未测出1.69±0.04
注：方法1、2检测的为新生隐球菌
三、讨论
rna特别是mrna的纯度和完整性主要取决于以下几个方面的因素：①不同生长期和生长条件 下的新生隐球菌 。本试验所获得的均为指数生长期新生隐球菌的总rna 。一般而言 ， 以yepd 为液体培养基 ， 250ml烧瓶中在100ml培养基内接种1个菌环的菌量 ， 30℃孵育过夜 ， 每1ml液 体中菌量可达108个 ， 我们的实验中 ， 经孵育过夜后 ， 每1ml的菌量为8.6×107个。当然 ， 为了获得足够的目的mrna的产量 ， 还需改变相应的生长条件 。②新生隐球菌rna的 全部释放 。我们的试验表明 ， 电动匀浆后3分钟 ， 均能彻底破坏新生隐球菌的结构 ， 使得其r na获得满意的释放 。③最主要者为实验过程中rna的降解和丢失 ， 特别是rnase的作用 。rnas e是一类生物活性非常稳定的酶 ， 存在于细胞内外 ， 因此预防其作用必须从两方面着手 ， 一 是实验必须在一个相对洁净的环境中进行 。操作中戴手套和口罩 ， 新的玻璃器皿和溶液均经 depc(二乙基焦碳酸盐)处理并经高压灭菌等 ， 可以有效地防止外源rnase的破坏；二是防止 细胞内rnase的作用［4］ ， 主要依靠异硫氰酸胍［3 ］ 。4mol/l异硫氰酸胍和β-巯基乙醇可以极度抑制rnase的活性 ， 而去污剂sa rcosyl又可以显著增强前者的作用 ， 因此 ， 我们将之应用于新生隐球菌rna的分离 ， 获得了 满意的效果 。电泳图和分光光度计显示 ， 三种方法新获得的rna均能满足分子生物学实验的 要求 ， 清晰的三条带分别为25s、18s和5s rrna ， 这占rna的绝大部分 ， 由于trna和mrna的含 量极微 ， 且mrna的大小差异不确定 ， 因此尚不足以检测到它们的存在 ， 更无法呈现清晰的可 辨的条带 。实验中所获得的新生隐球菌rna的产量均少于小鼠肝细胞而接近于啤酒酵母 ， 这 可能与小鼠肝细胞的转录、翻译活动较为活跃有关 。而方法3所获得的rna无论是纯度和产量 上均不低于方法1、2 ， 但后者易受到dna的污染 ， 特别是方法2 ， 可能由于licl的作用 ， 偶而 还会引起5s rna的丢失 。
【三种方法分离新生隐球菌RNA及其评价】

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