如何获得高质量的生物rna ， 是分子生物学研究的基础和极为关键的一步 。如northern印迹及杂交分析 ， 寡聚(dt)纤维素选择分离mrna ， cdna合成及体外翻译 ， rt-pc r等实验的成败 ， 很大程度上决定于rna的纯度和完整性 。我们参考哺乳动物细胞rna的抽提 方法 ， 并对其作了适当的修改 ， 成功地获得了高质量的rna ， 同时对它们的优劣进行了初步 的比较 。
文章插图
一、材料和方法
(一)菌株和试剂：菌株由我院中国医学真菌保藏管理中心隐球菌专业实验室提供 ， 编号为cc cc0112 ， 为临床分离株 ， 保存于沙堡固体培养基斜面上 。试剂有：①液体培养基yepd：1%酵 母抽提物、2%蛋白胨、2%葡萄糖 。②溶液d：4mol/l异硫氰酸胍、25mmol/l柠檬酸钠(ph7.0 )、0.5% sarcosyl、0.1mol/l β-巯基乙醇组成 。③盐酸胍匀浆1：8mmol/l盐酸胍、0. 1mmol/l醋酸钠(ph5.2)、5mmol/l β-巯基乙醇、0.5%十二烷基肌酸钠(sls) 。④盐酸胍 匀浆2：8mmol/l盐酸胍、0.1mmol/l醋酸钠(ph5.2)、1mmol/l β-巯基乙醇、20mmol/l e dta ph8.0 。⑤licl/尿素液：3mol/l licl、6mmol/l尿素 。⑥悬浮液：10mmol/l tris-cl ph7.0、1mmol/l edta ph8.0、0.5% sds 。
(二)方法：
1.菌株的培养和裂解：保藏的菌株接种到固体沙堡培养基斜面上 ， 活化3天后移种一整环菌 株于100ml yepd培养基中 ， 30℃振荡培养(200r/min)过夜 ， 取1ml菌液离心收集菌体(4000r/ min 5分钟) ， 无菌生理盐水清洗后重新离心收集菌体(4000r/min 5分钟) 。
2.rna的分离：方法1参见文献［1］ 。方法2参见文献［2］：以licl/尿素液悬浮菌体 ， 移 到组织匀浆器中 ， 电动匀浆3分钟 ， 匀浆液4℃静置4小时后移至eppendorf管中 ， 离心12 00 0r /min 30分钟 ， 弃上清液 ， 加入原匀浆液1/2容积的预冷licl/尿素液振荡充分混匀 ， 离心(12 00 0r/min 30分钟) ， 弃上清液 ， 用1/2原匀浆液容积的悬浮液溶解沉淀物 ， 加入等容积的酚∶ 氯仿∶异戊醇(25∶24∶1) ， 反复颠倒离心管 ， 混匀10分钟 ， 离心(3000r/min 5分钟) ， 吸取 上 清液 ， 加入1/10体积的3mmol/l naac(ph5.2)和2倍体积乙醇 ， 混匀 ， -20℃放置15分钟 ， 离 心沉淀rna(12 000r/min 15分钟) ， 弃上清液 ， 75%乙醇清洗rna ， 风干后加入50μl depc处 理 过的双蒸水 ， 溶解rna 。方法3［3］：以1ml溶液d悬浮菌体 ， 转移 到电动匀 浆器中 ， 冰浴中匀浆3分钟 ， 移至4ml eppendorf管中 ， 加入0.1ml 2mol/l浓度的醋酸钠 ， p h4.0 ， 充分混匀后加入1ml的酚-氯仿 ， 反复翻转混匀后剧烈摇荡10秒 ， 冰浴中静置15分钟 ， 样本在4℃条件下离心15分钟(13 000r/min) ， 吸取上清液 ， 加入1ml的异丙醇 ， 混匀后-2 0℃静置30分钟 ， 离心沉淀rna(13 000r/min 15分钟) ， 2倍体积的冰冻乙醇清洗后 ， 沉淀风 干 ， 以50μl depc处理过的无菌水溶解rna 。
3.rna的检测：各取10μl rna溶液与2μl溴酚蓝混匀后 ， 琼脂糖凝胶电泳检测rna ， 同时取4 μl rna样品 ， 加水至1ml混匀后 ， 转入分光光度计的石英比色杯中 ， 先用1ml水校正零点 ， 2 60nm和280nm分别读出吸光度a值 ， 检测rna的纯度和浓度 。
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