近年体外研究发现角朊细胞(kc)能产生多种影响黑素细胞(mc)增殖、黑素形成、形态、分化及其存活的细胞因子［1］，其中以碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)、内皮素-1(et-1)和干细胞因子(scf)最为重要 。halaban等的体外研究证实［2］，来源于kc的bfgf是正常mc的自然生长因子 。白癜风的基本病理改变是表皮内的mc减少或消失，其发生的确切原因仍不清楚 。了解kc所分泌的细胞因子bfgf在不同病期节段型白癜风皮损处kc的表达状况，为判断mc自体移植治疗白癜风后白斑区mc的转归提供一定的实验依据以及进一步认识该病的发生机制，均有一定意义 。为此，本实验采用原位杂交的方法，在分子水平观察了节段型白癜风皮损区kc表达细胞因子bfgf的
文章插图
一、材料和方法
(一)病例：胸背部节段型白癜风患者17例，男11例，女6例；年龄16～38岁；病程6个月至15年，平均7.5年；其中活动期8例，稳定期9例；取材部位为白斑与正常皮肤交界处的白斑皮肤 。患者分型、分期参照全国色素病学组修定的白癜风临床分型及疗效标准进行［3］ 。正常人对照采用胸背皮肤，共8例，男3例，女5例；年龄21～40岁 。所有标本取材后立即放入液氮冻存备用 。
(二)原位杂交：
1.探针的标记及原位杂交：0.8kb的bfgf cdna裸探针由美国abraham博士惠赠 。采用地高辛dna标记及检测试剂盒标记(德国宝灵曼公司)，标记过程按试剂盒规定步骤进行；原位杂交参照文献［4］进行 。
2.阴性对照：设置三种［4］：①以不加探针的杂交液进行杂交；②切片在杂交前用rnase处理，以降解细胞内所有的rna；③先用等量的未标记探针杂交后再用标记探针杂交 。
3.结果判断：在排除非特异性染色的情况下，原位杂交以胞浆内出现淡蓝色颗粒为阳性，典型的呈“月牙”状，每张切片在400倍镜下随机选择10个视野，计数每个视野中的阳性细胞，每例计数10张切片，取其平均值，作为该例标本的原位杂交阳性数 。
(三)统计学处理：实验结果用t检验进行统计学分析 。
二、结果
正常人皮肤组织可见细胞内bfgf的mrna表达，其分布主要为表皮内的kc、真皮内的成纤维细胞，表皮内表达bfgf mrna的kc主要分布在基底细胞层和棘细胞层 。在皮损处，阳性细胞主要分布于棘细胞层和颗粒层，真皮内阳性细胞与正常人对照间未见显著性差异 。各组阳性角朊细胞平均数分别是：正常人表皮13.6±5.3，稳定期白癜风10.2±4.4，活动期6.7±3.9 。稳定期白斑区kc的分布和其阳性细胞数与正常人皮肤间无显著性差异，而活动期白斑区kc的阳性细胞数则低于正常人对照(p＜0.05)，阴性对照所采用的3种阴性对照方法结果均为阴性 。
三、讨论
既往观察bfgf mrna的表达多在培养细胞中进行，已发现培养的kc、成纤维细胞和内皮细胞均能表达该因子的mrna［1，5］，在组织原位中的观察报道较少 。1991年scott等［6］报道用同位素标记bfgf的rna探针对正常皮肤进行原位杂交，首次证实了体外实验的发现，即皮肤组织内kc、成纤维细胞和内皮细胞表达bfgf，他们的实验观察到，正常表皮内从基底层至颗粒层细胞几乎全有密集的表达信号，各层之间的信号强弱无区别，真皮内成纤维细胞和内皮细胞的表达信号散在分布且强弱不一 。从我们的实验结果看，正常人表皮内并非所有的细胞表达bfgf，而仅有少部分基底层和棘层细胞有表达信号；真皮内可见散在阳性细胞，从分布和形态上可以确定是成纤维细胞和内皮细胞，但阳性细胞数也远低于scott等的报道，上述差异出现的原因可能与所用探针性质和杂交方法不同有关 。
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