5、载体与目的基因连接
如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接 。置于温箱，12-16℃，保温8-16h
6、转化（连接产物转化到感受态细胞中）
依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃，
12-16h 。
7、单克隆检测
挑单克隆
先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的
AMP，用枪头混匀；取1.5 mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种环（或黄枪头）挑单克隆，挑完后用枪吹打；之后，将挑好的菌摇4-5小时，至混浊即可 。
单克隆检测
以每管摇好的菌液为模板，以原有的引物进行PCR，然后将PCR产物跑电泳，观察电泳图像中那几管的条带正确，将正确条带相对应管的菌液再抽取100μL，加到3ml（有LB液体培养液，AMP+）试管中，过夜摇；第二天重摇，将摇好的菌取1ml于1.5mlEP管中送测序，并保种 。
注：①挑单克隆时，一定要挑单一圆润的菌落，有卫星斑的不挑 。
②别忘记往培养基中加AMP 。
③ 用接种环挑菌后，要在酒精灯上反复灼烧，然后再进行下一次挑菌 。
三、注意事项
1． 连接产物可短时间在-20℃保存，使用时可以取出进行后续实验；
2． 在细胞转化时，冰浴和热激要严格控制好时间；
3． 连接反应是DNA重组过程中的关键步骤，其成败的重要参数之一就是温度，因此要控
制好连接温度 。
4．进行黏末端连接时，会产生一定数量的载体自身环化分子，导致转化菌中过高的假阳性克隆背景 。针对这一问题，常采用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）去掉载体的5’-磷酸以抑制DNA片段的自身环化 。
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