近来研究表明 ， 原癌基因c-fos、c-myc的表达与细胞凋亡有关 。扁平苔藓中角质形成细胞凋亡是其一个重要的形态学特征 ， 但它是否与c-fos、c-myc基因表达调控有关目前尚不清楚 。我们通过研究扁平苔藓中角质形成细胞凋亡与c-myc、c-fos蛋白表达的关系来探讨扁平苔藓中角质形成细胞凋亡的机制 。
文章插图
一、材料和方法
1.研究对象：中国医科大学附属第一医院门诊16例扁平苔藓患者 ， 年龄27～74岁 ， 平均46岁 ， 均经病理证实 。正常人对照5例 ， 平均年龄54岁 ， 为外科手术患者 。
2.试剂与仪器：凋亡试剂盒（德国boehringer mannheim公司）；鼠抗人c-myc多克隆抗体 ， 兔抗人c-fos多克隆抗体（购于福建迈新公司）；计算机图象分析仪（luzex-f型 ， 日本） 。
3.标本制作：于皮损处作梭形切口切取皮肤组织 ， 深达皮下 ， 10％中性福尔马林固定 ， 石蜡包埋 ， 5μm连续切片 ， 1张行tunel法染色 ， 2张供免疫组化研究 。
4.tunel原位检测凋亡角质形成细胞：切片常规脱蜡；20μg/ml蛋白酶k37℃孵育15min；0.3％甲醇h2o2室温处理30min；渗透液（tritonx-100溶于0.1％柠檬酸钠溶液 ， 终浓度0.1％）4℃孵育2min；tunel反应混合物（含tdt和荧光素-d-utp）37℃孵育1h；辣根过氧化物酶标记的抗荧光素抗体37℃孵育30min；dab显色2min；苏木素复染5min；以不加反应混合物只加等体积的缓冲液作为阴性对照 ， 其他步骤不变 。在细胞核中有棕黄色颗粒者即为凋亡细胞 。
5.sp免疫组化检测：常规脱蜡 ， 分别对标本进行c-fos、c-myc免疫组化染色 ， dab显色 ， 苏木素衬染 。以pbs代替一抗作阴性对照 ， 其他步骤不变 。有棕黄色颗粒出现于细胞浆或细胞核者为阳性 。
6.凋亡指数（apoptosisindex ， ai）的计算：每张切片随机选取5个高倍视野（×400） ， 计算500个角质形成细胞中凋亡细胞所占百分比 。
7.定量图象分析：对扁平苔藓和正常人皮肤免疫组化结果进行计算机图象灰度值扫描 ， 每份标本随机取10个视野 ， 比较两组灰度值的平均值 ， 并进行t检验 。
8.凋亡与c-myc基因表达相关性分析：计算相关系数r ， 并做t检验 。
二、结果
1.tunel原位检测凋亡：扁平苔藓表皮各层可见散在分布凋亡细胞 ， 个别标本可见全层细胞出现凋亡 。正常人皮肤中未见或偶见凋亡细胞 ， 阴性对照中未见阳性结果 。
2.免疫组化染色结果：c-fos蛋白仅在1例扁平苔藓中有表达 ， 阳性颗粒见于表皮各层角质形成细胞核 。正常人对照中未见c-fos蛋白表达 。16例扁平苔藓及5例正常人对照c-myc蛋白均有表达 ， 阳性颗粒主要分布于细胞浆内 ， 少数分布于细胞核内 。胞核染色较强 ， 胞浆染色较弱 。定量图象分析（见表1）表明 ， 扁平苔藓c-fos表达与正常人皮肤差异无显著性（p＞0.05） ， c-myc表达明显高于正常人皮肤（p＜0.05） 。我们发现 ， 凋亡细胞数多 ， 相应标本中c-myc表达较强；反之 ， c-myc表达较弱 。3.c-myc与凋亡的相关性：扁平苔藓中c-myc表达与凋亡呈正相关（r=0.78 ， t=3.54 ， p＜0.05） 。
表1 扁平苔藓患者及正常人皮肤组织中c-fos、c-myc的表达
组别例数平均灰度值(±s)c-fosc-myc扁平苔藓1677.63±4.58132.94±34.84正常人皮肤575.87±4.2197.36±15.12t值 0.682.54p值 ＞0.05＜0.05
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