角质形成细胞生长因子(keratinocyte growth factor ， kgf)由rubin等[1]在1989年分离鉴定 ， 它特异地作用于上皮细胞 ， 促进其生长增殖和分化 ， 而银屑病的主要特征就是角质形成细胞生长增殖速度过快 ， 因而探讨kgf与银屑病发病的关系 ， 就显得很有意义 。我们抽提了12例银屑病皮损的总rna ， 进行rna印迹(northernblot) ， 结果如下 。
文章插图
一、资料和方法
(一)研究对象：实验组为经临床及组织病理学检查证实为进行期寻常型银屑病且未经治疗的患者12例 ， 均为男性 ， 年龄22～41岁 ， 病程14～90d 。取皮部位为背部皮损中心处 。标本为全层皮肤 ， 取下后立即置液氮中保存备用 。对照组12例 ， 均为正常人 ， 性别、年龄和取材部位均与实验组匹配 。
(二)材料和方法：
1.试剂：trizol:gibco公司产品;agarose ， prime-α-genelabeling system:promega公司产品 。
2.人kgfcdna探针的制备：人kgfcdna片段由中国人民解放军烧伤中心实验室惠赠 ， 含有人kgfcdna全长585bp中的345bp 。
3.方法：所有标本按文献[2]行总rna抽提 ， 吸取10μg总rna(约4.5μl) ， 加入2.0μl5×甲醛凝胶电泳缓冲液、3.5μl37％甲醛、10.0μl甲酰胺 ， 在65℃温育15min ， 进行甲醛变性凝胶电泳 ， 在20×ssc中经真空转移0.5h至尼龙膜上 ， 尼龙膜晾干后在80℃烘烤0.5～2h固定 ， 用6×ssc ， 2×denhardt ， 1％sds在68℃预杂交1～2h后 ， 将用α-32p-datp标记的人kgfcdna探针加入杂交管在杂交炉中68℃杂交16～24h ， 用1×ssc ， 0.1％sds洗膜 ， 再用0.1×ssc、0.1％sds洗膜后用x光片放射自显影 ， 于－70℃曝光6h至2周 。显影后用密度扫描仪分析结果 。内参照探针选用甘油醛－3一磷酸脱氢酶(glyceraldehyde3-phosphate dehydrogenase ， gapdh) 。
(三)实验结果统计分析：实验结果采用t检验 。
二、结果
(一)12例正常人皮肤和12例银屑病皮损的总rna经变性凝胶电泳后显示较清晰的5s、28s和18s条带 ， 如图1 。
图1 总rna电泳条带 ， 左泳道为正常人皮肤 ， 右泳道为银屑病皮损.
(二)每份标本约10μg总rna用于rna印迹法 ， 图2为1例正常人皮肤和1例银屑病皮损的kgfcdna探针杂交后曝光2周的显影 ， 左泳道为正常组织杂交显影 ， 右泳道为银屑病皮损杂交显影 ， 银屑病皮损的kgf杂交条带辉度明显强于正常人皮肤标本；图3为图2中2例标本经洗膜除去kgfcdna探针再用内参照gapdh探针杂交后曝光24h的显影 ， 左泳道为正常组织杂交显影 ， 右泳道为银屑病皮损 。从图3看 ， 正常人皮肤和皮损标本的gapdh杂交条带辉度大致相同 。
图2 角质形成细胞生长因子cdna探针杂交后曝光显影左泳道为1例正常人皮肤 ， 右泳道为银屑病皮损.
图3 为图2中2例标本经洗膜除去kgfcdna探针再用内
参照gapdh探针杂交后曝光24h的显影 ， 左泳道
为正常组织杂交显影 ， 右泳道为银屑病皮损.
(三)12例银屑病皮损的杂交条带辉度(kgf/gapdh)的均值为13.18±2.24 ， 12例正常人皮肤标本的杂交条(kgf/gapdh)的均值为4.83±4.94 ， 经t检验 ， t=5.33 ， p＜0.01 ， 说明两组标本kgf杂交条带的辉度存在显著性差异 ， 银屑病皮损组的kgf杂交条带显著强于正常人皮肤组 。
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