解脲支原体(uu)在人类疾病感染中的特征仍有争议，已知感染人类的uu具有种的特异性，用血清学的方法将其分为2个生物群及14个血清型，其中1、3、6、14为第1群，其余的10型为第2群[1?3] 。teng等[4]的研究认为uu的群特异性和多样性被编码在mb(multiple?banded)抗原基因中，本研究用第1群的uu3、14标准株对mb抗原5′端含群特异性抗原决定簇部分进行了pcr扩增，并对其表达的蛋白片段进行了抗原性检测 。
文章插图
一、材料与方法
1.uu3、14型标准株、uu3、6、8、14型标准抗血清由首都儿科研究所提供；pgex－2t、感受态大肠杆菌dh?5α由中国科学院动物所提供 。
2.pcr扩增：①dna模板制备：uu3、14型标准株的dna制备按我科实验室常规操作提取 。②引物设计：参照teng的设计合成一对特异性引物：ums51：5′tgtggatccttctgggctatgacattaggtgttacc3′；uma427：5′ctcgaattcacctggttgtgtagtttcaaagttcac3′(cyber?syn公司合成) 。在上游引物和下游引物分别引入bamhⅰ和ecorⅰ酶切位点 。③25μl反应体系：其中引物ums51、uma427、dna模板各1μl 。④反应条件：94℃、62℃、72℃各1min，35个循环 。扩增产物用琼脂糖凝胶进行电泳及dna片段回收试剂盒回收和纯化 。
3.重组表达质粒的构建：将目的dna片段及表达质粒pgex－2t分别经bamhⅰ和ecorⅰ酶切处理，得到粘性末端，在t4dna连接酶的作用下连接，将重组质粒转化到大肠杆菌dh－5α中，用酶切和pcr的方法挑选阳性菌落 。
4.iptg诱导蛋白的表达：设含有生殖支原体304bp的重组质粒及空白载体pgex－2t为对照 。诱导剂iptg的终浓度为0.1mmol/l，诱导时间4h 。超声粉碎细菌后，加入等体积的2×sds加样缓冲液，100℃加热3min，10000r/min，离心5min，取上清液20μl进行sds－page凝胶电泳 。
5.western印迹法检测表达蛋白的抗原性：①将表达的蛋白经sds－page凝胶电泳后，按常规方法将其转至硝酸纤维膜(nc)上，将nc膜用含3％bsa的封闭液室温封闭1、2h 。②兔uu3、6、8、14型抗血清1∶10稀释后用大肠杆菌dh?5α裂解液预吸收4h，然后用血清稀释液稀释至1∶500，分别与nc膜4℃孵育过夜，次日用hrp标记的抗兔igg室温反应1h 。③酶底物联苯二胺(dab)用底物缓冲液配制：将nc膜置入dab溶液中显色 。
二、结果
1.用ums51?uma427扩增uu3、14型标准株，得到429bp的目的dna片段 。克隆并经酶切和pcr方法筛选阳性克隆菌株 。
2.iptg诱导蛋白表达结果：含uu3、14型目的dna片段表达质粒的大肠杆菌表达相对分子质量约43000的融合蛋白，仅含pgex?2t的大肠杆菌表达相对分子质量约26000的蛋白片段，含生殖支原体重组质粒的大肠杆菌表达相对分子质量约35000的融合蛋白 。
3.western印迹法检测结果：含uu3、14型mb抗原基因5′端重组质粒的阳性克隆诱导表达的蛋白片段与uu3、6、14型标准抗血清均出现明显的阳性反应，与uu8型抗血清未见条带出现 。
三、讨论
mb抗原是uu的外膜抗原，在人类感染中为占优势的识别抗原，根据对uu3型的mb抗原基因序列分析，mb抗原为一个1230bp开放性的阅读框架，可编码409个氨基酸 。在teng等的研究中证实，mb抗原基因存在于所有的血清型中，基因的5′端区域是群特异性的标志[4] 。在不同的血清型，mb抗原的大小可能是不同的，但其5′端的n区是保守的 。
本研究参照teng对uu3型的mb抗原基因5′端设计的引物ums51－uma427扩增出uu3、14型mb抗原基因的5′端，得到约429bp的目的dna片段，克隆后，用iptg在大肠杆菌中成功诱导了相对分子质量43000融合蛋白的表达，除去pgex－2t质粒本身表达的相对分子质量约26000蛋白片段，得到预期大小相对分子质量17000的表达蛋白 。并证实uu3、14型mb抗原基因5′端基因片段所编码的蛋白片段含有第1群特异的抗原决定簇 。uu6型在第1群中由于不含hinfⅰ酶切位点，表现出第2群的特征，在亲缘关系上与其他3型可能相对较远，我们选择uu6型的抗血清与表达的蛋白仍然出现明显的阳性反应，证实该蛋白片段确为第1群所共有 。由于uu3、14型所表达的蛋白与抗血清的反应完全相同，提示其具有相同的抗原决定簇 。这一结果支持了teng提出的mb抗原的n端存在群特异性的抗原决定簇的结论 。
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