近年来 ， 国外许多研究结果认为kaposi肉瘤与巨细胞病毒、疱疹病毒-6型、乙肝病毒、支原体等感染有关［1］ 。chang等［2］发现kaposi肉瘤患者皮损有类疱疹病毒(hhv-8) ， 并测定出其碱基排列顺序 。为此 ， 我们用一针对hhv-8基因的引物进行扩增 ， 以研究hhv-8感染与kaposi肉瘤发病的关系 。
文章插图
一、材料和方法
(一)标本来源：日本九州大学医学部皮肤科及病理科近10年明确诊断为kaposi肉瘤1例(抗hiv抗体阳性) ， 临床可疑kaposi肉瘤2例(1例抗hiv抗体阳性 ， 另1例阴性) ， 血管肉瘤、化脓性肉芽肿各1例 。
(二)实验方法：
1.模板dna的制备：将标本切成10μm厚度 ， 移至1.5ml的微离心管中 ， 用二甲苯脱蜡、无水乙醇脱二甲苯后真空干燥20分钟 ， 取含200μg/ml蛋白酶k的50mmol/l te缓冲液100μl加入标本中 ， 37℃过夜 ， 混匀后95℃加热10分钟灭活蛋白酶k ， 然后15?$000r/min 10分钟 ， pcr反应时取上清液10μl 。
2.寡聚核苷酸引物［2］：引物1：5′agccgaaaggattccaccat3′ ， 引物2：5′tccgtgttgtctacgtccag3′ ， 这对引物扩增的片段为233bp 。
3.pcr扩增：采用50μl反应体系 ， 其中包括0.5μl taq dna聚合酶(5u/l) ， 4μl dntps(每种dntp 0.2mmol/l) ， 0.5μl的引物1及引物2(0.4nmol/l) ， 10μl模板dna ， 10×pcr反应缓冲液5μl(含mgcl２、kcl、tris-cl、triton x-100) ， 无菌双蒸水29.5μl ， 混匀后其表面覆盖一滴石蜡油 ， 在pcr自动循环仪上按下列条件进行循环：①94℃ 5分钟 ， 58℃ 5分钟 ， 72℃ 2分钟；②94℃ 1分钟 ， 58℃ 1分钟 ， 72℃ 1分30秒 ， 共38个循环；③94℃ 1分钟 ， 58℃ 1分钟 ， 72℃ 10分钟 。反应结束后 ， 在含有0.5μg/ml溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶中电泳25分钟 ， 紫外灯下观察结果 。
4.产物特异性鉴定：取纯化的pcr扩增产物2份各10μl ， 分别加入apaⅰ及aluⅰ各1.5μl ， 10×酶解反应缓冲液2μl ， 灭菌双蒸水6.5μl ， 37℃温浴2小时 ， 然后94℃加热5分钟终止反应 ， 取消化液在含有0.5μg/ml溴化乙锭的2.5%琼脂糖凝胶中电泳30分钟 ， 紫外灯下观察结果 。
二、结果
5例标本中 ， 明确诊断kaposi肉瘤者为阳性(此患者抗hiv阳性) ， 临床可疑kaposi肉瘤2例中抗hiv阴性者为阳性 ， 抗hiv阳性者为阴性 ， 化脓性肉芽肿及血管肉瘤均阴性 。阳性扩增产物可被限制性内切酶apaⅰ及aluⅰ切为142bp、91bp及133bp、100bp的2个小片段 ， 证实扩增产物为预期片段(图1) 。
三、讨论
【聚合酶链反应检测Kaposi肉瘤组织中类疱疹病毒DNA】 我们利用pcr技术 ， 对可疑kaposi肉瘤患者的病理标本进行hhv-8的检测 ， 结果临床及病理明确诊断kaposi肉瘤的1例患者2处皮损均为阳性 ， 此患者抗hiv阳性 ， 为艾滋病相关型 。临床可疑kaposi肉瘤2例中 ， 有1例hhv-8阳性 ， 此患者抗hiv阴性 ， 病理虽无kaposi肉瘤的典型改变 ， 但也有内皮细胞及血管的增生 ， 考虑为经典型kaposi肉瘤；另1例hhv-8阴性者 ， 抗hiv阳性 ， 临床虽可疑kaposi肉瘤 ， 但病理仅见真皮浅层有少许淋巴细胞浸润 ， 无kaposi肉瘤改变 。由此可见 ， 不论经典型或艾滋病相关型 ， 均可检测到hhv-8 。由于kaposi肉瘤的病理改变与血管肉瘤、肉芽肿性疾病不易区分 ， 我们将血管肉瘤、化脓性肉芽肿的病理组织也进行了hhv-8的检测 ， 结果均阴性 ， 证实了hhv-8仅与kaposi肉瘤有关 。
经验总结扩展阅读
- 异维A酸联合抗生素治疗聚合性痤疮一例
- 真菌特异性通用引物的聚合酶链反应系统的实验与临床研究
- 青蒿琥酯对ⅠⅣ型变态反应的影响
- 如何处理和防治鼻咽癌的放疗反应及后遗症
- 银屑病患者淋巴细胞对葡萄球菌和链球菌超抗原刺激的增殖反应
- 连接酶链反应用于淋病的诊断
- 特非那丁致严重心脏毒性反应一例
- 异维A酸等治疗聚合性痤疮八例
- 角膜各层损害后有何不同的反应
- NdYAG激光治疗文眉所致的异物反应