已经证明，在很大一部分白癜风患者血清中存在着抗正常黑素细胞自身抗体［1，2］ 。该类抗体可介导对黑素细胞的免疫损害［3］，并在实验动物上诱发与白癜风类似的病变［4］ 。我们采用免疫组化方法，对白癜风患者、非白癜风患者和健康人血清抗黑素瘤细胞抗体进行了检测 。
文章插图
一、材料和方法
(一)试剂：小牛血清购自华美生物工程公司，羊抗人igg(γ链)-辣根过氧化物酶(hrp)结合物(二抗)，为sigma产品 。hrp底物3，3′-二氨基联苯胺(dab)，为serva进口分装产品 。
(二)黑素瘤细胞：来源于恶性黑素瘤患者，细胞株名libr，由本校免疫教研室金伯泉教授提供 。对照细胞为食道癌细胞(eca109) 。
(三)血清：取自20例白癜风患者、31例非白癜风住院患者(本校西京医院)和23例正常人(体检健康者) 。其中白癜风患者均为活动期非节段型门诊患者，未合并其他疾病，男8例，女12例，平均年龄31岁 。非白癜风住院患者中，各类肿瘤18例，自身免疫性疾病(风湿、类风湿和皮肌炎)8例，感染性疾病5例 。
(四)细胞涂片的制作：上述细胞经体外培养后，离心收集，并用磷酸盐缓冲生理盐水(pbs)洗涤1次 。用pbs悬浮，适当调节细胞密度，用微量加样器涂于十二孔载玻片上，每孔约5μl，在室温下自然干燥 。载玻片浸于丙酮中固定约10分钟，干燥后密封保存于-20℃或4℃下，备用 。
(五)免疫组化：按常规病理方法 。细胞涂片先浸于0.3% h２o２-甲醇液约30分钟，除去内源性过氧化物酶活性 。用小牛血清封闭后，加1∶5稀释血清，37℃下孵育1小时 。洗涤后加适当稀释的hrp-二抗结合物，37℃下作用1小时 。最后加dab底物液显色，约20分钟 。按常规方法衬染、透明、封片 。
二、结果
【白癜风患者血清抗黑素瘤细胞抗体的检测】 黑素瘤细胞涂片进行免疫组化染色后，于光镜下观察结果 。细胞出现棕褐色者为阳性(图1a)，未见棕褐色染色者为阴性(图1b) 。阳性者细胞浆呈均一着色，细胞核不着色 。
受检查的20例白癜风患者中，有13例出现阳性结果，阳性率为65% 。31例非白癜风住院患者仅有3例阳性，阳性率10% 。23例门诊体检健康者无1例出现阳性结果 。经χ２检验，白癜风患者组与非白癜风患者组、健康人组间的差异均有非常显著性差异(χ２分别为17.28和21.48，p＜0.01)，而非白癜风患者组与健康人组之间的差异无显著性(χ２=2.30，p＞0.05) 。
用白癜风患者的阳性血清对食道癌细胞(eca109)进行免疫组化染色，未见细胞出现棕褐色着色(图1c) 。非白癜风患者组的三份阳性血清均使对照细胞出现着色 。白癜风患者组的部分阳性血清尚经间接免疫荧光检查，结果与免疫组化一致：黑素瘤细胞胞浆呈均一荧光(图1d) 。
三、讨论
大量的临床观察表明，在黑素瘤患者中，白癜风的发病率远高于普通人群；而恶性黑素瘤继发白癜风的患者往往预后较好 。bystryn［5］认为白癜风是对黑素瘤的一种天然免疫 。本研究观察到，20例白癜风患者中有13例患者血清使黑素瘤细胞的免疫组化染色呈阳性，阳性率为65%，证明白癜风患者体内存在着抗黑素瘤细胞抗体 。该组抗体与白癜风抗黑素细胞自身抗体是否属同一组抗体，有待进一步研究 。
白癜风患者组阳性血清不与食道癌细胞反应，说明它们与黑素瘤细胞的结合是特异的 。与此相反，非白癜风患者组的三份阳性血清与黑素瘤细胞的反应是非特异的，因为它们同时也与食道癌细胞反应 。本研究观察到的阳性血清均使黑素瘤细胞浆呈比较均一的着色，在间接免疫荧光中使细胞浆呈均一荧光，提示阳性血清所识别的抗原位于黑素瘤细胞胞浆，但不排除同时位于细胞浆和细胞表面的情况 。白癜风患者体内存在着能与黑素瘤细胞特异结合的igg抗体，说明其对黑素瘤具有一定的特异性体液免疫力，支持bystryn的观点［5］ 。如何利用这种免疫力以对抗黑素瘤，是值得今后探讨的问题 。
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