【Bowen病与鳞状细胞癌细胞凋亡的研究】 bowen病(bd)与鳞状细胞癌(scc)均属于表皮角朊细胞肿瘤 。恶性肿瘤常出现细胞周期的异常，而肿瘤细胞分裂与凋亡可能是决定肿瘤生长快慢的重要因素 ［1］ 。多数bd病变始终局限在表皮内，但约3%～5%的患者可发展成scc 。至今，引起这种临床差异的细胞分子学机理仍不清楚，我们推测可能与细胞凋亡有关，故采用原位特异dna片段标记方法(tunel)对bd和scc的细胞凋亡进行比较研究，探讨其可能的意义 。
文章插图
一、材料与方法
1.组织标本：4例bd，均为男性，年龄54～73岁；6例scc，男女各3例；年龄51～82岁 。皮肤肿瘤组织均来源于日本京都大学皮肤科，经10%福尔马林液固定、石蜡包埋、组织切片4μm。作常规he染
图 1 bowen病表皮中见不规则荧光小体(120×)色，经组织病理确诊 。
2.tunel染色：组织切片载于经硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane)处理的玻片(日本)， 37℃固定24小时 。按mori等［2］的改良方法作凋亡细胞标记 。主 要 步骤：切片经二甲苯脱蜡，乙醇梯度脱水后用20μg/ml蛋白酶k(dako公司)，37℃处理15分钟；然后用末端脱氧核糖核酸转移酶(tdt)缓冲液(含30mmol三羟甲基氨基甲烷、140mmol二 甲胂酸钠、1mmol氯化钴)室温下浸浴5分钟；将组织切片用含12.5μmol生物素化dutp(boeh ringer mannheim，德国)，0.15u/μl tdt(takara公司)的tdt缓冲液，37℃孵育70分钟；再用tb缓冲液(含300mmol氯化钠、30mmol枸橼酸钠)室温下处置15分钟以终止反应 。然后，用结合fitc的亲和素(oncor公司)进行dna标记，最后用1μg/ml的碘化丙啶(propidium iodi de， pi)作对比染色，荧光显微镜下观察 (microphot-sa，尼康) 。阳性对照采用oncor 公司提供的断奶4天后的大鼠乳腺切片；
阴性对照采用省略tdt或生物素化dutp处置的切片 。
二、结果
tunel染色结果中凋亡细胞采用半定量表示 。其中，(++)示凋亡细胞5%，(+)示0%＜凋亡细胞 ≤5%，(-)示凋亡细胞为零；凋亡细胞显示为细胞核着荧光染色 。其中，1例bd凋亡细胞为(++)、3例为(+)，6例scc均为(-) 。bd表皮内可见散在大的圆形或卵圆形及不规则的荧光小体 (图1) 。此外，多数荧光小体部位与he染色所示的多核巨细胞及角化不良细胞一致 。scc表皮及侵入真皮组织的非典型角朊细胞中未见阳性荧光细胞 。
三、讨论
tunel方法是一种原位特异的细胞dna片段标记方法 。由于凋亡时dna断裂暴露3′-oh末端，在末端脱氧核糖核酸转移酶的作用下，生物素化dutp与其3′-oh末端相连，再经结合荧光素的亲和素反应而呈特异的荧光染色，因此可以直接定位研究组织细胞凋亡 。有作者曾对bd 进行超微结构观察发现棘层内有较多细胞呈凋亡细胞的结构改变［3］ 。本文结果亦显示bd表皮内散在凋亡细胞，并且多与组织病理中的多核巨细胞及角化不 良细胞部位一致，提示这些细胞可能就是凋亡细胞，而kanerva亦指出某些皮肤病中出现的 角化不良细胞绝大多数以及扁平苔藓病理改变中的civatte小体均属凋亡细胞［ 4］ 。本文中，scc肿瘤组织中未见阳性凋亡细胞 。
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