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革兰氏染色四种染液,常用微生物染色的方法( 三 )

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细菌的等电点较低，pH值大约在2―5之间，故在中性、碱性或弱酸性溶液中 ， 菌体蛋白质电离后带阴电荷；而碱性染料电离时染料离子带阳电 。因此 ， 带阴电的细菌常和带阳电的碱性染料进行结合 。所以，在细菌学上常用碱性染料进行染色 。
影响染色的其它因素 ， 还有菌体细胞的构造和其外膜的通透性 ， 如细胞膜的通透性、膜孔的大小和细胞结构完整与否 ， 在染色上都起一定作用 。此外，培养基的组成、菌令、染色液中的电介质含量和pH、温度、药物的作用等，也都能影响细菌的染色 。
二、染料的种类和选择
染料分为天然染料和人工染料两种 。天然染料有胭脂虫红、地衣素、石蕊和苏木素等，它们多从植物体中提取得到，其成分复杂，有些至今还未搞清楚 。目前主要采用人工染料，也称煤焦油染料 ， 多从煤焦油中提取获得，是苯的衍生物 。多数染料为带色的有机酸或碱类，难溶于水，而易溶于有机溶剂中 。为使它们易溶于水，通常制成盐类 。
染料可按其电离后染料离子所带电荷的性质，分为酸性染料、碱性染料、中性（复合）染料和单纯染料四大类 。
1、酸性染料
这类染料电离后染料离子带负电，如伊红、刚果红、藻红、苯胺黑、苦味酸和酸性复红等，可与碱性物质结合成盐 。当培养基因糖类分解产酸使pH值下降时，细菌所带的正电荷增加，这时选择酸性染料，易被染色 。
2、碱性染料
这类染料电离后染料离子带正电，可与酸性物质结合成盐 。微生物实验室一般常用的碱性染料有美兰、甲基紫、结晶紫、碱性复红、中性红、孔雀绿和蕃红等，在一般的情况下，细菌易被碱性染料染色 。
3、中性（复合）染料
酸性染料与碱性染料的结合物叫做中性（复合）染料，如瑞脱氏（Wright）染料和基姆萨氏（Gimsa）染料等，后者常用于细胞核的染色 。
4、单纯染料
这类染料的化学亲和力低，不能和被染的物质生成盐，其染色能力视其是否溶于被染物而定，因为它们大多数都属于偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如紫丹类（Sudanb）的染料 。
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三、制片和染色的基本程序
【革兰氏染色四种染液,常用微生物染色的方法】微生物的染色方法很多，各种方法应用的染料也不尽相同 ， 但是一般染色都要通过制片及一套染色操作程序 。
1、制片
在干净的载玻片上滴上一滴蒸馏水，用接种环进行无菌操作，挑取培养物少许，置载玻片的水滴中，与水混合做成悬液并涂成直径约1厘米的薄层 ， 为避免因菌数过多聚成集团，不利观察个体形态，可在载玻片之一侧再加一滴水，从已涂布的菌液中再取一环于此水滴中进行稀释，涂布成薄层，若材料为液体培养物或固体培养物中洗下制备的菌液，则直接涂布于载玻片上即可 。
2、自然干燥
涂片最好在室温下使其自然干燥，有时为了使之干得更快些，可将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长 ， 以防标本烤枯而变形 。
3、固定
标本干燥后即进行固定，固定的目的有三个：
1）杀死微生物，固定细胞结构 。
2）保证菌体能更牢的粘附在载玻片上 ， 防止标本被水冲洗掉 。
3）改变染料对细胞的通透性 ， 因为死的原生质比活的原生质易于染色 。
固定常常利用高温，手执载玻片的一端（涂有标本的远端），标本向上 ， 在酒精灯火焰外层尽快的来回通过3―4次，共约2―3秒钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃）,放置待冷后 ， 进行染色 。

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