以上这种固定法在微生物实验室中虽然应用较多普遍，但是应当指出，在研究微生物细胞结构时不适用，应采用化学固定法 。化学固定法最常用的固定剂有：酒精（95%），酒精和醚各半的混合物 ， 丙酮，1―2%的饿酸等 。饿酸能很快固定细胞但不改变其结构，故较常用 。应用饿酸固定细胞的技术如下：在培养皿中放一玻璃，在玻璃上放置玻璃毛细管，在毛细管中注入少量的1―2%饿酸溶液，同时在玻璃上再放置湿标本涂片的载玻片 ， 然后把培养皿盖上，经过1―2分钟后把标本从培养皿中取出，并使之干燥 。
4、染色
标本固定后，滴加染色液 。染色的时间各不相同，视标本与染料的性质而定 ， 有时染色时还要加热 。染料作用标本的时间平均约1―3分钟，而所有的染色时间内，整个涂片（或有标本的部分）应该浸在染料之中 。
若作复合染色 ， 在媒染处理时，媒染剂与染料形成不溶性化合物，可增加染料和细菌的亲和力 。一般固定后媒染，但也可以结合固定或染色同时进行 。
5、脱色
用醇类或酸类处理染色的细胞 ， 使之脱色 。可检查染料与细胞结合的稳定程度，鉴别不同种类的细菌 。常用的脱色剂是95%酒精和3%盐酸溶液 。
6、复染
脱色后再用一种染色剂进行染色，与不被脱色部位形成鲜明的对照，便于观察 。革氏染色在酒精脱色后用番红 ， 石碳酸复红最后进行染色，就是复染 。
7、水洗
染色到一定的时候，用细小的水流从标本的背面把多余的染料冲洗掉 ， 被菌体吸附的染料则保留 。
8、干燥
着色标本洗净后，将标本晾干，或用吸水纸把多余的水吸去，然后晾干或微热烘干，用吸水纸时 ， 切勿使载玻片翻转，以免将菌体擦掉 。
9、镜检
干燥后的标本可用显微镜观察 。
综上所述，染色的基本程序如下：
制片→固定→媒染→染色→脱色→复染→水洗→干燥→镜检 。
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四、染色方法
微生物染色方法一般分为单染色法和复染色法两种 。前者用一种染料使微生物染色，但不能鉴别微生物 。复染色法是用两种或两种以上染料，有协助鉴别微生物的作用 。故亦称鉴别染色法 。常用的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法，此外还有鉴别细胞各部分结构的（如芽胞、鞭毛、细胞核等）特殊染色法 。食品微生物检验中常用的是单染色法和革兰氏染色法 。
1、单染色法
用一种染色剂对涂片进行染色 ， 简便易行，适于进行微生物的形态观察 。在一般情况下 ， 细菌菌体多带负电荷，易于和带正电荷的碱性染料结合而被染色 。因此，常用碱性染料进行单染色，如美兰、孔雀绿、碱性复红、结晶紫和中性红等 。若使用酸性染料，多用刚果红、伊红、藻红和酸性品红等 。使用酸性染料时，必须降低染液的PH值，使其呈现强酸性（低于细菌菌体等电点），让菌体带正电荷 ， 才易于被酸性染料染色 。
单染色一般要经过涂片、固定、染色、水洗和干燥五个步骤 。
染色结果依染料不同而不同：
石碳酸复红染色液：着色快，时间短，菌体呈红色 。
美兰染色液：着色慢，时间长，效果清晰，菌体呈兰色 。
草酸铵结晶染色液：染色迅速，着色深，菌体呈紫色 。
2、革兰氏染色法
革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立 。
细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌此色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+），后者为革兰氏阴性菌（G―） 。为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红等进行复染 。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色 。有芽胞的杆菌和绝大多数和球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现负反应 。
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