单纯疱疹病毒(hsv)糖蛋白g(gg)基因位于hsvus4序列区 ， 是型间差异最大的一个糖蛋白基因 ， 目前对其功能尚不甚明了 ， 以此作为“靶位点”分型检测临床样本单纯疱疹病毒感染的pcr方法报道亦较少 。我们建立并初步评价了一种可同时分型检测hsvgg基因的pcr方法 ， 现报道如下 。
文章插图
一、材料与方法
1.临床标本：选择我科门诊临床诊断为生殖器疱疹(gh)的病例40例 ， 共收集gh早期皮疹(水疱、脓疱)标本17份 ， 中晚期皮疹(溃疡、结痂创面)标本23份 ， 泌尿生殖道拭子标本40份 。
2.hsv培养及鉴定：以vero细胞分离培养hsv[1] 。阳性培养结果以单克隆抗体间接免疫荧光试验予以鉴定(lp10抗hsv-ⅰgg ， ap1抗hsv-ⅱgg ， 均由英国剑桥大学minson教授惠赠) 。hsv国际参考株hsv-ⅰf株 ， hsv-ⅱ333株由湖北医科大学病毒研究所提供 ， 并以微量空斑计数法标定病毒滴度 。
3.hsvgg基因pcr方法：pcr引物设计参照已经公布的hsvdna序列[1] ， 通过pcgene软件比较hsv-ⅰ及hsv-ⅱdna的同源性 ， 选择hsv-ⅰus4序列区4351bp～4370bp片段为hsv-ⅰ上游引物；hsv-ⅱhindⅲl序列区4707bp～4726bp片段为hsv-ⅱ上游引物；hsv-ⅰus4序列4818bp～4837bp(或hsv-ⅱhindⅲl序列区4903bp～4922bp)片段为型共同下游引物 。按文献处理临床标本 ， 构建pcr扩增反应体系并进行扩增反应[2] 。温度循环按94℃45s、58℃45s、72℃1min进行 。经2％琼脂糖凝胶电泳判断结果 ， 出现216bp条带为hsv-ⅱ阳性 ， 出现490bp条带为hsv-ⅰ阳性 ， 对临床标本进行检测时以0.75空斑形成单位(pfu)hsv-ⅰf株及1.25pfuhsv-ⅱ333株培养液为阳性对照(参见结果部分) 。
对hsvgg基因pcr法与细胞培养法结果不一致的标本 ， 以常用的hsvdna聚合酶基因pcr法再次检测[3] 。本文数据分析以sas软件包进行χ2检验或精确概率法检验 。
二、结果
1.引物设计：pcr引物选自gg基因跨膜区编码区 ， 3条引物g＋c含量均在61％左右 ， 以pcroligo软件检索引物内部无重复序列 ， 无发夹结构形成 ， 引物间无4个以上连续碱基配对 ， 且与已知dna序列无配合 。扩增产物在490bp及216bp处出现明亮带型 ， 未见其它分子量带型出现 。以标准病毒液为模板 ， 当hsv-ⅰ及hsv-ⅱ量分别低于0.75pfu及1.25pfu时 ， 即无明显扩增产物出现 。
2.临床标本细胞培养法与hsvgg基因pcr法检测结果：80份临床标本细胞培养法与gg基因pcr法阳性者分别为32份(40％)及42份(52.5％) ， 两者差异具有显著性(p=0.005)；生殖器疱疹不同类型标本的阳性检出率见表1 ， 中晚期皮疹标本hsvgg基因pcr法的阳性检出率显著高于细胞培养法(p=0.033) 。30份细胞培养法与gg基因pcr法均阳性的标本 ， 29份两法分型结果一致(hsv-ⅰ、hsv-ⅱ、hsv-ⅰ及hsv-ⅱ混合感染分别为2例、26例及1例) ， 1份细胞培养法示hsv-ⅰ及hsv-ⅱ混合感染 ， 但gg基因pcr法示hsv-ⅱ单独感染 ， 经hsvdna聚合酶基因pcr法再检测仍为hsv-ⅱ单独感染 。
细胞培养法与hsvgg基因pcr法出现14份不一致检测结果 ， 12份gg基因pcr法阳性但细胞培养法阴性 ， 经hsvdna聚合酶基因pcr法再检测全部阳性 。2份gg基因pcr法假阴性 ， 经hsvdna聚合酶基因pcr法再检测1份阳性 ， 1份阴性 。
【聚合酶链反应检测单纯疱疹病毒糖蛋白G基因片段】
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