【丹参对系统性硬皮病成纤维细胞胶原基因表达的影响】 丹参治疗系统性硬皮病(ssc)有较好的疗效[1] 。我们曾观察到丹参可抑制ssc患者皮肤成纤维细胞增殖,降低细胞培养基中可溶性胶原的含量[2],但引起胶原合成减低的作用机制尚不清楚 。我们以ssc患者皮肤成纤维细胞为研究对象,通过观测丹参加入细胞培养基后对该细胞ⅰ、ⅲ型前胶原及胶原酶mrna含量的影响,从胶原基因表达方面对丹参治疗ssc的药理机制进行探讨 。
文章插图
一、材料与方法
(一)丹参制剂:丹参注射液是上海第一制药厂产品(批号95038,每ml折合丹参生药1.5g);丹参素购自上海医科大学天然药化教研室;原儿茶醛(3,4-二羟基苯甲醛)系上海试剂一厂产品(批号86-07-01) 。制剂配制见参考文献[2] 。
ⅰ、ⅲ型前胶原及胶原酶cdna探针的制备:所采用的3个质粒分别是含有人ⅰ型前胶原α1链cdna片段(670bp)的质粒phcaliu[3],含人ⅲ型前胶原α1链cdna片段(705bp)的质粒phfs3[4],以及含胶原酶cdna片段(1.7kb)的质粒puc19[5] 。3种探针的序列、合成、定性在上述文献中有详述 。所有质粒都转化在大肠杆菌中,用标准方法扩增,碱裂解法提取质粒,peg8000纯化质粒dna,ecorⅰ对3种质粒进行酶切,使之线性化 。用地高辛随机寡核苷酸引物合成均一标记的cdna探针,并检测标记效果 。
(三)皮肤成纤维细胞培养:在局麻下分别切取1例22岁女性肢端型ssc患者前臂外侧活动性硬化皮损边缘皮肤以及1例整形外科手术取之青年女性前臂外侧皮肤 。按leroy法进行皮肤成纤维细胞原代培养并传代增殖 。实验选用第3~6代细胞 。培养瓶底面积175cm2,待细胞接近融合时,更换培养基,加入丹参药液, 每个浓度重复3瓶 。阴性对照组加入dmem培养基,阳性对照组加入地塞米松使浓度为1μg/ml 。加药后24h收获细胞 。
(四)总rna的提取和斑点杂交:采用trizol制剂(life technologies),按改良胍-酚-氯仿一步法提取细胞总rna 。测定rna含量,估算其纯度 。将rna点样于硝酸纤维素薄膜上,每点含量20μg 。将薄膜在80℃烘箱烘干2h后封入塑料袋中,加入预杂交液(high sds buffer),50℃预杂交1h后改换有探针的杂交液,杂交过夜 。第2天取出薄膜,进行洗脱,用blocking reagent封闭后,放入含地高辛抗体稀释液中振荡孵育,再洗脱后加入显色液中静置暗处显色,当斑点出现后,适时用te终止反应 。将结果在图像分析仪上进行灰度数字转换 。实验数据用t检验进行分析 。
二、结果
(一)丹参对ssc患者皮肤成纤维细胞ⅰ、ⅲ型前胶原和胶原酶mrna表达的影响测定结果:丹参水溶性提取物丹参注射液、丹参素及原儿茶醛作用于ssc患者皮肤成纤维细胞24h后,对该细胞ⅰ、ⅲ型前胶原mrna的表达具有显著抑制作用,对胶原酶mrna的表达则具有显著促进作用 。阳性对照地塞米松(1μg/ml)则对该细胞ⅰ、ⅲ型前胶原和胶原酶mrna的表达均具有显著抑制作用 。详见表1 。
表1 丹参对系统性硬皮病患者皮肤成纤维细胞ⅰ、ⅲ型前胶原及
胶原酶mrna表达的影响(±s)
组别ⅰ型前胶原mrna(n=3)ⅲ型前胶原mrna(n=3)胶原酶mrna(n=3)阴性对照107.30±16.18489.50±32.54304.40±24.26地塞米松(1μg/ml)4.99±2.170.89±0.36101.60±12.17丹参注射液5mg/ml13.16±2.5110.22±4.21**2304.14±76.35*2.5mg/ml22.43±0.59*42.99±5.11*820.10±63.25*丹参素50μg/ml8.23±3.9411.22±2.79*970.30±53.15*25μg/ml11.46±1.75**2.15±1.15554.60±34.67*原儿茶醛100μg/ml12.71±2.63**8.03±3.1*106.90±8.2250μg/ml22.99±4.47*369.10±26.68*522.10±55.77*25μg/ml16.28±4.36*253.60±30.25*1026.36±94.25* 注:表中数值为杂交斑点实际积分吸光度值;丹参制剂与阴性对照比较,p均〈0.01;丹参制剂与地塞米松比较,*p〈0.01,**p〈0.05
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